Jensen nasceu em Dallas, no estado estadunidense do Texas, é filho de Donna Joan Shaffer e Roger Alan Ackles. Jensen tem um irmão mais velho, Joshua, e uma irmã mais nova, Mackenzie. Tem ascendência inglesa, escocesa e irlandesa. Havia planejado estudar medicina esportiva no Universidade de Tecnologia de Texas e tornar-se fisioterapeuta, antes de mudar para Los Angeles para se tornar ator Atualmente vive em Los Angeles, Califórnia. Após ser modelo, Ackles começou a concentrar-se na carreira de ator em 1996. Ele apareceu em vários papéis pequenos, como em Mr. Rhodes, Sweet Valley High e Cybill, antes de se juntar ao elenco da novela da NBC Days of Our Lives, como Eric Brady, em 1997. Ganhou em 1998 Soap Opera Digest Award for Best Male Newcomer (algo como Ator Revelação Masculino) e foi nomeado três vezes (1998, 1999 e 2000) para o Daytime Emmy Award para Mais Jovem Ator numa Série de Drama por seu trabalho em Days of Our Lives.
Ackles deixou Days of Our Lives em 2000 e passou a participar da mini-série Blonde sobre a vida de Marilyn Monroe. Ele também disputou o papel do jovem Clark Kent em Smallville, mas este foi oferecido para o ator Tom Welling. Depois disso, participou como convidado na série de televisão Dark Angel na FOX, em 2001, como Ben/X5-493, o psicopata, serial killer "irmão" da personagem principal Max/X5-452 (interpretada por Jessica Alba). Sua personagem morreu no episódio, mas Ackles retornou à série na segunda temporada como o clone de Ben, Alec/X5-494. Ele permaneceu com a série até seu cancelamento, em 2002.
Em 2003 fez diversas aparições na série Dawson's Creek como C.J., da Warner Bros. Em 2004 participou ativamente na quarta temporada da série Smallville, interpretando a personagem Jason Teague, assistente do treinador de futebol e também namorado de Lana Lang (Kristin Kreuk), filho da malevolente Genevieve Teague (Jane Seymour). Após uns meses ausente, Ackles voltou à televisão em 2005 para atuar em Supernatural, uma série sobre fenômenos paranormais da WB, no papel do politicamente incorreto Dean Winchester ao lado do seu irmão Sam Winchester (Jared Padalecki), viajando pelos Estados Unidos à procura do seu pai, John Winchester (Jeffrey Dean Morgan), e a procurar respostas sobre a morte sobrenatural de sua mãe. O negócio da família é eliminar demônios, fantasmas e outras criaturas sobrenaturais.
Também atuou no filme "Devour" (Adoradores do Diabo), no qual contracena com seu pai. Seu filme mais recente é "My Bloody Valentine 3-D". Jensen também está na lista dos Homens mais Sexys do Mundo, ocupando o 16º lugar. A série Supernatural é a mais assistida dentre os jovens no mundo, desbancando até então a série Smallville.
Atualmente é casado com a atriz estadunidense Danneel Harris, eles se casaram em 15 de maio de 2010